|
|
Charakterizace rekombinantní myší glutamátkarboxypeptidasy III
Janoušková, Karolína ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII, PSMA, NAALADasa) je transmembránová metalopeptidasa a díky štěpení specifických substrátů β-citryl-L-glutamátu (BCG), N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamátu (NAAG) a polyglutamylovaných folátů (Pte-Glun) je studována jako potenciální terapeutický cíl. Enzymy, které by mohly kompenzovat enzymovou aktivitu a funkce GCPII, jsou proto rovněž relevantními cíli enzymologického výzkumu. Jedním z homologů GCPII s podobnou enzymovou aktivitou je glutamátkarboxypeptidasa III (GCPIII, NAALADasa II). U rekombinantní myší GCPIII ještě nebyly stanoveny kinetické parametry KM a kcat popisující její aktivitu. Myší GCPIII je důležité kineticky charakterizovat a porovnat s lidským ortologem, aby bylo zjištěno, jestli je enzymová aktivita tohoto enzymu v myším modelu srovnatelná se situací u člověka. Rekombinantní myší GCPIII byla kineticky charakterizována. Kinetické parametry rekombinantní myší GCPIII pro substráty NAAG a BCG byly změřeny metodou štěpení radioaktivně značeného substrátu. Kinetika reakce pro substrát Pte-Glu2 byla analyzována pomocí HPLC. Z hlediska štěpení NAAGu je lidská GCPIII účinnější než myší ortolog, v případě substrátu BCG jsou enzymy srovnatelné. Tyto výsledky nás posunou blíže k pochopení role GCPIII v nejpoužívanějším zvířecím modelu. Klíčová slova:...
|
|
|
Příprava glutamátkarboxypeptidasy III v savčím expresním systému
Šimonová, Lenka ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Role glutamátkarboxypeptidasy II v savčím organismu je již poměrně dobře prozkoumaná, avšak o jejím homologu - glutamátkarboxypeptidase III - je známo jen minimum informací. Pro strukturní a funkční charakterisaci proteinu je zapotřebí velké množství proteinu, který je možno získat expresí v tkáňových kulturách. Vlastnosti proteinu mohou být ovlivněny posttranslačními mo- difikacemi, přičemž různé organismy provádějí různé posttranslační modifikace. Proto jsme se rozhodli vyvinout systém pro produkci rekombinantního GCPIII v savčích buňkách. Nejprve byl zaveden savčí expresní systém HEK 293-6E jako náhrada dosavadního hmyzího ex- presního systému. Výhodou tohoto savčího expresního systému je jeho snadná kultivace v suspenzních podmínkách a možnost transientní transfekce. Dále byly optimalizovány transfekční podmínky pro tento systém pomocí exprese zeleného fluorescenčního proteinu, pro snadnou detekci pomocí průtokové cyto- metrie. DNA kódující extracelulární část myší GCPIII (mEXSTII) byla klonována do pěti různých expres- ních plasmidů s použitím různých značek pro afinitní chromatografii (polyhistidinová kotva nebo tzv. Fc značka) na N- nebo C-konci připravovaného proteinu. Připravenými plasmidy byly transfekovány buňky. Pomocí imunochemické detekcce byla v médiích testována přítomnost...
|
|
|
Charakterizace rekombinantní myší glutamátkarboxypeptidasy III
Janoušková, Karolína ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII, PSMA, NAALADasa) je transmembránová metalopeptidasa a díky štěpení specifických substrátů β-citryl-L-glutamátu (BCG), N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamátu (NAAG) a polyglutamylovaných folátů (Pte-Glun) je studována jako potenciální terapeutický cíl. Enzymy, které by mohly kompenzovat enzymovou aktivitu a funkce GCPII, jsou proto rovněž relevantními cíli enzymologického výzkumu. Jedním z homologů GCPII s podobnou enzymovou aktivitou je glutamátkarboxypeptidasa III (GCPIII, NAALADasa II). U rekombinantní myší GCPIII ještě nebyly stanoveny kinetické parametry KM a kcat popisující její aktivitu. Myší GCPIII je důležité kineticky charakterizovat a porovnat s lidským ortologem, aby bylo zjištěno, jestli je enzymová aktivita tohoto enzymu v myším modelu srovnatelná se situací u člověka. Rekombinantní myší GCPIII byla kineticky charakterizována. Kinetické parametry rekombinantní myší GCPIII pro substráty NAAG a BCG byly změřeny metodou štěpení radioaktivně značeného substrátu. Kinetika reakce pro substrát Pte-Glu2 byla analyzována pomocí HPLC. Z hlediska štěpení NAAGu je lidská GCPIII účinnější než myší ortolog, v případě substrátu BCG jsou enzymy srovnatelné. Tyto výsledky nás posunou blíže k pochopení role GCPIII v nejpoužívanějším zvířecím modelu. Klíčová slova:...
|
|
|
Příprava glutamátkarboxypeptidasy III v savčím expresním systému
Šimonová, Lenka ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Role glutamátkarboxypeptidasy II v savčím organismu je již poměrně dobře prozkoumaná, avšak o jejím homologu - glutamátkarboxypeptidase III - je známo jen minimum informací. Pro strukturní a funkční charakterisaci proteinu je zapotřebí velké množství proteinu, který je možno získat expresí v tkáňových kulturách. Vlastnosti proteinu mohou být ovlivněny posttranslačními mo- difikacemi, přičemž různé organismy provádějí různé posttranslační modifikace. Proto jsme se rozhodli vyvinout systém pro produkci rekombinantního GCPIII v savčích buňkách. Nejprve byl zaveden savčí expresní systém HEK 293-6E jako náhrada dosavadního hmyzího ex- presního systému. Výhodou tohoto savčího expresního systému je jeho snadná kultivace v suspenzních podmínkách a možnost transientní transfekce. Dále byly optimalizovány transfekční podmínky pro tento systém pomocí exprese zeleného fluorescenčního proteinu, pro snadnou detekci pomocí průtokové cyto- metrie. DNA kódující extracelulární část myší GCPIII (mEXSTII) byla klonována do pěti různých expres- ních plasmidů s použitím různých značek pro afinitní chromatografii (polyhistidinová kotva nebo tzv. Fc značka) na N- nebo C-konci připravovaného proteinu. Připravenými plasmidy byly transfekovány buňky. Pomocí imunochemické detekcce byla v médiích testována přítomnost...
|
host ::
RSS.